产品简介：

 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称ROS Assay Kit)试剂盒采用 DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探针方法，是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。活性氧包括超氧自由基（O2•⁻）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、过氧亚硝基（ONOO−）、一氧化氮（•NO）等，它们参与了细胞增殖生长、发育分化、衰老和凋亡等许多生理和病理过程。 DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后可以被酯酶水解为不能透过细胞膜的 DCFH（dichlorofluorescin），当活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（dichlorofluorescein），荧光在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近有最大波峰，荧光水平与细胞内活性氧水平成正比。本试剂盒提供的活性氧检测系统本底水平低，灵敏度高，重复性好，操作简便。

产品特点：

l    适用范围：贴壁细胞、悬浮细胞、新鲜动物组织

l  工作波长：最佳激发波长 500（500±15 nm），最佳发射波长 525 (530±20nm)，也可按照 FITC 荧光检测条件检测

l    所需设备：流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计等

储存和稳定性:

-20℃避光冻存。本试剂盒自订购之日起一年内有效。

试剂盒组成:

注意事项：

l  探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

l  探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

l  尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

l  本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

使用说明：

一、 细胞样本：

A．收集细胞，进行活性氧测定

1.       细胞收集：

悬浮细胞：2000rpm，离心5min，收集沉淀，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤2次，1000rpm，离心5min，弃上清，取细胞沉淀；

贴壁细胞：吸去培养液，用0.01M PBS或无血清培养液反复吹打，使细胞层全部进入 PBS 或培养液中，收集细胞悬液，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤2次，1000rpm，离心5min，弃上清，取细胞沉淀；

2.       DCFH-DA探针稀释。根据预实验的结果，用无血清培养基或者PBS将DCFH-DA探针稀释成工作液（提供的初始浓度为10mM）。

注意：DCFH-DA工作液浓度可在100 nM~20 μM范围内，需进行预实验确定最适浓度，一般情况下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要获得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml无血清培养或PBS中混匀即可。

3.       加入DCFH-DA探针，用稀释好的 DCFH-DA 荧光探针重悬细胞沉淀，一般情况下，细胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml。 并设置阴性与阳性对照。

阴性对照：不加探针，只加入 PBS 或培养基的细胞。

阳性对照：已加入DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞悬液，推荐试剂工作浓度0.1mM（该浓度可以根据预实验调整）。

4.       37℃孵育细胞20-60分钟。通常情况下，20-30分钟即可。

注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA浓度等有关。可以每隔 5min颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

5.       1000g，离心5min，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 缓冲液洗涤2次，重悬细胞。

6.       进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

B. 不收集细胞，直接将探针加入培养基测定

1.        DCFH-DA探针稀释。根据预实验的结果，用无血清培养基或者PBS将DCFH-DA探针稀释成工作液（提供的初始浓度为10mM）。

注意：DCFH-DA工作液浓度可在100 nM~20 μM范围内，需进行预实验确定最适浓度，一般情况下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要获得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml无血清培养或PBS中混匀即可。

2.        加入 DCFH-DA 探针，去除细胞培养基上清，加入稀释好的 DCFH-DA 探针，加入探针的体积以能盖住细胞为宜，通常 6 孔板单孔不少于 1ml。并设置阴性与阳性对照。

阴性对照：不加探针，只加入培养基的细胞。

阳性对照：已加入 DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞，推荐试剂工作浓度20-100 μM。

3.        37℃孵育细胞20-60分钟。通常情况下，20-30分钟即可。

注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

4.        弃去上层培养液，用无血清培养液或 0.01M PBS 反复吹打，使细胞层全部进入 PBS 或培养液中。

5.        收集细胞悬液，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤2次，去除未进入细胞内的探针，1000rpm，离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次，重悬细胞。

6.        进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

二、动物组织样本

1.        细胞悬液制备：可采用单细胞悬液制备仪或传统的组织处理方法如：酶解法、研磨法等制备单细胞悬液；

2.        DCFH-DA探针稀释。根据预实验的结果，用无血清培养基或者PBS将DCFH-DA探针稀释成工作液（提供的初始浓度为10mM）。

注意：DCFH-DA工作液浓度可在100 nM~20 μM范围内，需进行预实验确定最适浓度，一般情况下10 μM DCFH-DA工作液能取到理想效果。如要获得10 μM DCFH-DA工作液10ml，取10μl M DCFH-DA (10mM)加入到10ml无血清培养或PBS中混匀即可。

3.        加入 DCFH-DA 探针，用稀释好的 DCFH-DA 荧光探针重悬细胞沉淀，并设置阴性与阳性对照。

阴性对照：不加探针，只用0.01M PBS 重悬的细胞。

阳性对照： 已加入 DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞悬液，推荐试剂工作浓度 20-100 μM。

4.        37℃孵育细胞20-60分钟。通常情况下，20-30分钟即可。

注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

5.        1000g，离心 5min，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，重悬细胞.