产品简介

检测粪便中病原菌等微生物、以及一些未消化食物样品的RNA是现代诊断的重要手段。由于粪便中存在大量抑制因子，常规的RNA纯化方式不能有效地去除这些杂质，导致下游实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。Stool RNA Kit采用了简便的硅胶柱纯化方式和独特的溶液系统，能有效去除动物粪便中各种影响下游实验抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。一次可处理0.05-0.5g样品，纯化的DNA可直接用PCR等实验。

试剂盒组成

储存和稳定性

室温保存，一年有效。Buffer RC2与Buffer RC3可能有沉淀产生，37℃水浴溶解后即可。

实验前准备

请详细阅读该手册并熟悉各个步骤，在开始之前准备好所有的试剂盒组分和必需的器材。

试剂准备：

缩的RNA Wash Buffer II 需用无水乙醇按如下稀释：

R1301 加8 ml；R1305加入52 ml ；R1306与R1307每瓶加入104 ml 无水乙醇

Buffer RC1使用前加入终浓度为1%的巯基乙醇，如1ml Buffer RC1加入10μl巯基乙醇。

需自备器材

无水乙醇    1.5ml离心管    水浴    离心机

操作步骤

1. 称0.3-0.5g粪便置于2ml离心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入500μl Buffer RC1（注意加入5μl巯基乙醇） ，100μl Buffer RC2以及500μl水饱和酚（需自备）。涡旋器高速震荡3-5min。

注意：对含水量丰富的样品，可以预先离心除去部分水分后再称去样品。Buffer RC2是我司独特的腐殖酸除去剂，100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤， Buffer RC2的量可以适当增加，但不能超过250μl，否则会严重影响RNA的得率。

2. 加入200μl Buffer RC3（RC3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），涡旋5-10分钟。

3. 加入200μl氯仿涡旋。12000 rpm(~13000×g)离心5钟，转600μl上清到1.5ml离心管中，加入180μl Buffer RC4混匀。

注意：转移上清时确保不要吸取到沉淀，转移的上清量最好不超过80%。

4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)离心5钟。 转移上清到新的1.5ml离心管中。

5. 加入二分之一上清体积的 Buffer RC5与与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向500μl 上清中加入250μl Buffer C3与500μl无水乙醇。

6. 把上述混匀的液体转移到GBC分离柱上。10,000×g离心30秒以结合RNA，弃去滤出液体。

纯化柱最大容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。

7. 向GBC吸附柱中加入500μl Wash Buffer I 离心30秒，弃废液。

8. 向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 秒，倒掉废液，GBC吸附柱放入收集管中。

注意：Wash Buffer II使用前请先检查是否已加入无水乙醇）

9.向GBC吸附柱 中加入600μl Wash Buffer II，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30秒，倒掉废液，将GBC吸附柱放入收集管中。

10. 12,000 rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉废液，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的实验

11. 将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加30-100μl RNase-free Water，室温放置2 分钟，4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)离心1分钟。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。且RNA 应保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA 得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。